。 ATGC 最好随机分布, 避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是 3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。⑤引物 3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 1.GUS 酶活性检测( 组织化学染色定位法) ??? ?gus 基因存在于某些细菌体内,编码β- 葡萄糖苷酶( β-glucuronidase , Gus ) ,该酶是一种水解酶,能催化许多β- 葡萄糖苷酯类物质的水解。因为绝大多数植物细胞内不存在内源的 Gus 活性,因此 gus 基因广泛用作转基因植物的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应有。此外, gus 基因3’端与其他结构形式的融合基因也能够正常表达,所产生的融合蛋白仍具有 Gus 活性,这对研究外源基因表达的具体细胞部位提供了方便条件,也是它相对于其他报告基因的一个优点。该法以 5-溴-4- 氯-3- 吲哚-β-D 葡萄糖苷酸酯( X-Gluc )为底物,通过显色反应可直接观察到组织器官中 gus 基因的活性。该方法不用将酶从组织中提取出来,而是使底物进入被测的植物组织、细胞或原生质体之中。将被测材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温,若组织、细胞、原生质体发生了 gus 基因转化,表达出 GUS ,在适宜条件下该酶可将 X-Gluc 水解生成蓝色物质,初始产物并不带颜色,为无色的吲哚衍生物,后经氧化二聚作用形成 5,5 ’- 二溴-4,4 ’- 二氯靛蓝染料,此靛蓝染料使具有 Gus 活性的部位或位点呈现蓝色,可用肉眼或在显微镜下观察到。
全文预览
