融合蛋白

表达后所得的蛋白质产物称为融合蛋白(fusion protein , FP) 。二、融合蛋白技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术,可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。(一)融合蛋白技术的特点?融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。原核表达系统的特点是时程短,费用低, 是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰;大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物, 需要复杂的变性和复性过程;大量蛋白的分泌较困难。(一)融合蛋白技术的特点?真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多,甚至可被改造成人源型;真核细胞易被转染,具有遗传稳定性和可重复性;产物可被分泌, 提纯简单, 成本低。(二)融合蛋白技术的内容?构建融合蛋白的基本原则是, 将第一个蛋白的终止密码子删除,再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因,以实现两个基因的共同表达。具体步骤有: 1.进行目的基因的克隆: 根据基因序列互补原则,设计合适的引物序列,以 cDNA 为模板,利用 PCR 技术扩增不同的目的 DNA 片段。(二)融合蛋白技术的内容 2.在载体中进行重组: 通过限制内切酶将两个 DNA 片段进行酶切并回收,然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接,并克隆到高表达质粒载体中,构建重组质粒。(二)融合蛋白技术的内容 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。(三)融合蛋白技术的关键?在构建融合蛋白中,一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker ) ,即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短, 可能影响两蛋白高级结构的折叠,从而相互干扰;如果接头序列太长,又涉及免疫原性的问题,因为接头序列本身就是新的抗原。