活菌计数, 各菌株菌悬液每毫升活菌含量不低于 100 亿个。二、制苗过程?4. 灭活将上述各菌株的菌悬液按等量混匀后加入终浓度为 0.4% 的甲醛溶液 37 ℃灭活 48 h ,其间每隔 6~8 h 振荡 1 次。?5.灭活检验取灭活后的菌液接种于普通营养琼脂, 37℃培养 24小时,应无任何细菌生长。二、制苗过程?6. 制备油苗(1)制备油相取10号白油 94份、 Span-80 6 份、硬脂酸铝 2份, 140 ℃煮沸约 1小时,或 121 ℃高压 30分钟,冷却后为油相。(2)制备水相 Tween-80 4 份装入带玻璃珠的瓶中灭菌, 冷却后加入灭活好的混合菌液 96 份振摇至 Tween-80 完全溶解为水相。(3)乳化油相与水相按 2~3 ∶1 比例混合, 先将油相倾入胶体磨内,在低速搅拌下缓缓加入水相,然后高速( 10 000r/min ) 搅拌 5 min ,乳化制成油乳剂疫苗, 定量分装备检。三、无菌与安全性检验?将制备好的灭活苗分别接种于营养琼脂平板和肉汤中, 37 ℃培养 24 h ,均无细菌生长。将疫苗分别接种于 10只10日龄雏鸡 0.25 ml/ 只, 与10只120 日龄蛋鸡 0.5 ml/ 只,观察 14 d ,接种 24 ~48 h 后全部健活,且注射部位无异常。四、最小免疫剂量试验?将10 日龄 50 只鸡平均分成 5 组免疫(接种量分别为 0.1 ml 、0.2 ml 、0.25 ml 、0.3 ml 和不注射对照组), 120 日龄鸡 50 只平均分成 5 组免疫(接种量分别为 0.3 ml 、0.4 ml 、 0.5 ml 、0.6 ml 和不注射对照组), 15 d 后对雏鸡和成鸡用活菌混合液 0.25 ml 和 0.5ml 攻毒, 观察 14 d 。鸡只全部健活的最小免疫量,即为最小免疫剂量。
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