反转录pcr

检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆,并有可能与Taq酶的测序技术相组合,使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。?RT-PCR—一步法和两步法两步法:由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且容易相互干扰,常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因,及定量PCR。两步法则是将RT和PCR分别进行,这样使得两个反应充分发挥各自的特点,更为灵活而且严谨,适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板,以及多个基因的RT-PCR。?RT-PCR—一步法和两步法外源基因的转录表达基因表达?基因表达指基因组中某基因在细胞中转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。?基因表达的改变预示着细胞在分子水平上的变化。它往往是细胞形态功能变化之前的变化。DNARNAProtein转录翻译目前研究转基因植物外源基因转录表达的常用方法1、RT-PCR (RNA)2、Northern blot (RNA)3、real-time PCR (RNA)反转录PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCROligo dT, 逆转录酶特异性引物, Taq酶用途: 获得所需cDNA片段;检测基因表达注意问题:1、PCR效率差异,重复性2、内参选定3、共同扩增4、扩增片段位置5、mRNA丰度?仪器旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,0.2ml PCR微量管,双面离心管架,PCR仪,台式离心机,琼脂糖凝胶电泳系统,水漂,恒温水浴。?试剂RNA 反转录酶,3U/μL Taq DNA聚合酶,PCR缓冲液(10×,MgCl2 free),25mM MgCl2,dNTP,引物,模板质粒pMD18-T-NK,无菌dd water。实验操作步骤:1)RNA提取:关键防止RNA降解RNA提取的成功与否是RT-PCR检测中最重要的步骤。