钟,小心侧倒掉上清CaCl2,留沉淀菌体。9、再把菌体悬浮在200微升100mmol/LCaCl2的溶液中,置于冰上作为转化的受体菌液。此制备的感受态细胞应在此步后1小时至24小时内使用,效率比较高。10.在事先制备好的含50μg/mlAmp的LB平板表面加40mlX-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收,备用。(二)重组DNA转化1.取0.2ml大肠杆菌感受态细胞,在无菌条件下,加入到连接液的Eppendorf管,混匀,置冰浴中30分钟。2.冰浴后,将正在转化反应的细胞悬浮液加入已调好42℃的的恒温水浴槽内,保温2分种。3.热冲击处理后的细胞易死亡,应迅速倒入LB培养液1毫升,(无抗菌素LB液,有助于基因表达)马上置37℃水浴1小时,每10分钟翻转1次。4.用移液器取0.1毫升的转化菌液直接涂布含50μg/mlAmp、40mlX-gal储液和4μlIPTG储液LB固体平皿上,共涂布三个培养皿。5.用移液器取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液0.1毫升直接涂布于含50μg/mlAmp、40mlX-gal储液和4μlIPTG储液LB固体平皿上,作为受体菌对照。6.将第14、15步涂布培养皿先放室温15分钟左右,使涂布上的菌液干燥不会流动。然后倒置放于恒温箱中37℃培养过夜。7.第二天取出培养皿,观察对照平皿和转化平皿菌落情况。对照平皿因受体菌对Amp敏感,故不能在含Amp的培养基上生长。转化平皿是否有兰色和白色菌落生成?如果长出兰色菌落,说明自连的载体pUC18质粒已转入受体菌,但目的基因没有接入载体。如果长出白色菌落,说明目的基因已接入载体,重组质粒的转化子因此丧失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal和ITPG存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落。五、结果和讨论比较对照平皿和转化平皿,讨论转化成败原因.
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