上述操作,直至第六号培养菌培养12h后,打开培养皿盖,取出载玻片,将1至6号培养菌依次置于显微镜下观察并拍照。观察野生型灰葡萄孢菌孢子萌发、芽管、菌丝和菌落形态。Р4.4灰葡萄孢菌孢子悬液的制备Р?活化后的灰葡萄孢菌再培养7天(28 ℃),待菌体产生孢子即可。用无菌水洗菌体数次Р得到孢子悬液,孢子悬液用血球计数板计数,将孢子悬液的浓度稀释到2×105个孢子/ml待用。Р4.5灰葡萄孢菌的复壮Р 选取四个大小相近、相对成熟、无损伤的番茄,在超净工作台内用解剖刀分别撕去一平方厘米区域大小的表皮,并在这些区域用分别接野生型和突变体灰葡萄孢菌孢子悬液,用记号笔分别标记(野生型CK,突变体TG)。找一长方体或正方体盒子,去掉盖子用细线将其缠绕形成网状顶部,取适量无菌水倒至底部,将接有孢子悬液的番茄置于其网状顶平面,保鲜膜将其密封,于28℃下培养二至三天,观察菌种生长情况,并拍照。Р5实验结果Р通过观察野生型灰葡萄孢菌在培养基上的萌发状态,发现野生型灰葡萄孢菌生长12h萌发长出单极性芽管,24h菌丝分支,36h后长满菌丝,分支增多, 48h时形成分生孢子头,部分开始散发分生孢子,60h时散发分生孢子,72h时分生孢子散发完,部分还在散发分生孢子(图1)。通过观察不同时段野生型灰葡萄孢菌在培养基上的菌落生长状态,发现24h时培养基上无肉眼可见菌落长出,36h时有明显的菌落长出,48h长满整个培养基,60h长至培养基边缘,72h有更多菌丝长出,菌落颜色加深(图2)。野生型和突变体孢子侵染番茄,置室温下均有菌丝长出,说明两类孢子均具有侵染活性(图3)。Р12hР24hР36hР48hР 72hР 60hР Р图1野生型灰葡萄孢菌不同时段的细胞生长形态Р72hР36hР24hР12hР60hР48hР 图2 野生型灰葡萄孢菌不同时段菌落生长形态Р?РAРBР图3野生型和突变体灰葡萄孢菌侵染番茄
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