别抗性突变的细胞在平板上长成菌落。纯化后进一步进行抗性试验,就可以得到所需的抗药性菌株。Р 为了便于选择适当的药物浓度,分离抗药性突变株常用梯度平板法。本实验用梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素、青霉素和红霉素突变株。Р 【实验器材】Р 大肠杆菌; LB液体培养基; LB琼脂培养基; 链霉素、青霉素和红霉素;70%乙醇;无菌吸管,烧杯,试管,玻璃涂棒,水浴锅等。Р 【操作步骤】Р 1.接种大肠杆菌与盛有5ml L B培养液的试管中,37℃震荡培养24h。Р 2.在水浴锅中融化LB培养基。Р 3.倒10ml已融化不含药物的LB琼脂培养基于无菌培养皿中,将培养皿一端垫起使培养皿表面在垫起的一端刚到培养皿的底与边的交界处凝固。Р 4.在凝固的平板底部高琼脂一边标上低,放平后在底层培养基上分别加入每毫升含有100ug链霉素、青霉素和红霉素的LB琼脂培养基10ml,凝固后制得链霉素浓度从0到另一端的100ug∕ml的梯度平板。Р 5.用1ml无菌吸管吸取0.2ml大肠杆菌培养液加到梯度平板上。用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布到整个平板表面。如用蘸有乙醇Р 并经火焰灭菌的玻璃涂棒,可在火焰旁或伸进培养皿在板盖上充分冷却以免烫死细胞。Р 6.将平板于37℃培养48 h.Р 7.选择1—2个生长在梯度平板中部的单个菌落,用无菌接种环接触该菌落朝高药物浓度的方向划线。Р 8.将平板倒置于37℃培养48 h。Р 【注意事项】Р 1.玻璃涂布棒在火焰上灼烧后要待其冷却后再进行涂布,以免烫死细胞;可以蘸上乙醇后在火焰上灼烧,以缩短冷却的时间。Р 2.制备含药平板时,务必使药物与培养基充分混匀。Р 3.严格无菌操作,勿将杂菌误为抗药性大肠杆菌。Р 注:Р LB(Luria-Bertani)培养基Р 蛋白胨 10克酵母膏 5克Р NaCl 10克蒸馏水 1000mlР PH 7.0Р 121℃灭菌20min.
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