基酸极性和分子量大小不同等性质,使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后,采用不同的pH值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来。洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色,从而定量各种氨基酸。测定样品中各种游离氨基酸含量,可以除去脂肪等杂质后,直接上柱进行分析。测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解,使蛋白质完全变成氨基酸后才能上柱进行分析。Р定量测定的依据是氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。不是所有氨基酸都如此,脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物,故需在另外波长处定量测定。Р操作方法:Р样品处理:如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质,必须将样品预先除去杂质后再进行酸水解处理。去除杂质的方法如下:Р去糖和淀粉:把样品用淀粉酶水解(不溶→可溶)。然后用乙醇溶液洗涤,得蛋白质沉淀物。Р去脂肪:先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离心或过滤抽提,得蛋白质沉淀物。Р去核酸:将样品在10%氯化钠溶液中,85℃加热6小时(增大溶解度),然后用热水洗涤,过滤后将固形物用丙酮干燥即可。Р去无机盐:样品经水解后含有大量无机盐时须用阳离子交换树脂进行去盐处理。Р酸水解:称取经干燥的蛋白质样品数mg,加入2m1 5.7mol/L盐酸,置于110°C烘箱内水解24小时,然后除去过量的盐酸,加缓冲溶液稀释到一定体积,摇匀。取一定量的水解样品上柱进行分析。Р3、气相色谱法Р原理:将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色谱分析的衍生物—三氟乙酰丁酯。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐(TFAA)的酰化两个步骤。将酰化好的氨基酸衍生物进行气相色谱分析。Р4、液相色谱法Р原理:蛋白质样品经酸或碱水解后再用丹磺酰氯(强荧光剂)进行衍生化作用而溶解于流动相溶液中,采用高压液相色谱仪分离并用荧光检测器进行测定,即可测定出各种氨基酸的含量。
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