.5μgР低丰度Р烟草叶片Р1mgР0.05-0.1μgР玉米叶片Р1mgРAAAAAAР关于RNA的分布Р总RNA Р Р 真核细胞的RNA主要分为:Р 1、mRNA: 1-5% ? 起始密码:AUG 终止密码:UAA,UAG,UGA。? 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。? 1)免受核酸酶破坏,? 2)起始、促进蛋白质合成。? 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。? Р 2、tRNA: 10-15%Р 3、rRNA: 80-85%? 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt ? 小亚基40S: 18S=1874ntР方法Р1.异硫氰酸胍/苯酚法(TRIZOL)Р2.胍盐/β-巯基乙醇法Р适用于大部分动植物材料,但对于次生代谢产物较多的植物材料提取RNA效果较差Р适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料Р3.沉淀法Р4. 介质吸附:硅介质·阴离子交换树脂·磁珠Р原理Р1РAРBРCР破碎组织Р提取纯化Р鉴定分析Р破碎组织Р使用高浓度变性剂TRIZOL,可溶解蛋白质,破坏细胞结构,使核蛋白与核酸分离,失活RNA酶Р得到RNA,DNA,蛋白质,细胞碎片РTRIZOL的组成Р※苯酚的主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。?※0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。?※异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。?※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。Р提取纯化Р苯酚Р氯仿Р异丙醇Р乙醇РDNA,蛋白质沉淀到有机相?RNA留在水相Р释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相,从而得以分离Р提取核酸Р沉淀RNAР洗涤RNA
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