型归于哪一类细胞或组织;二是很难排除在成熟动物上由于发育缺陷所引起的异常表型。新霉素抗性基因(neo)和单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tK)为正负选择(positiveandnegativeselection)系统,是筛选和富集同源重组细胞广泛应用的方法;该方法虽然使基因打靶技术可适用于任何外源目的基因,但也有一个严重的缺陷,即发生同源重组的细胞基因组中总留有外源的选择标记(neo)基因;该基因可能影响相邻基因的表达,不利于对突变表型的精确分析。以Cre/LoxP系统与基因打靶技术相结合的条件性基因敲除技术可克服上述的局限性。72020/2/225.借助Cre-loxP系统的条件性基因敲除一般情况下,利用Cre-loxP系统进行基因操作时,会采用两种转基因动物进行杂交,即一种带Cre的转基因动物和一种带loxP序列的转基因动物进行交配,使得后代既带Cre又带loxP基因,然后Cre重组酶会识别loxP位点,导致基因重组。启动子的时空特异性就决定了基因重组的时空特异性。82020/2/22转基因动物依赖的Cre-loxp系统在应用中遇到的问题转基因动物的难以获得:有很多Cre/Loxp转基因动物没有被制作出来,自己制作转基因动物耗时且成本高。动物交配很耗时间:转基因动物达到实验室后,首先需要将转基因动物的数量扩大,然后经过至少2代交配才能拿到基因敲除的小鼠,而交配一代小鼠至少需要2个月时间,所以至少需要半年时间才能拿到基因敲除的小鼠。区域或者组织特异性不高:因为转基因小鼠依赖的基因敲除的特异性只能依赖于启动子的调控,而有些启动子并不能完全符合科研工作者对于区域或者组织特异性的要求,这样就会使实验结果不精确。92020/2/226.改良的Cre-loxp系统:病毒依赖的基因重组通过病毒引入Cre或loxP元件,结合一种转基因小鼠是比较常用的方式。102020/2/22
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