PCR实验原理及数据分析内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程及注意事项生工荧光定量产品选择指南*荧光定量PCR原理--定义实时定量PCR技术:利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较:对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析,无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测*荧光定量PCR原理--常用名词概念扩增曲线荧光阈值Ct值**荧光定量PCR原理--扩增曲线*Cycle(循环数)Rn(荧光强度)BaselineLg-linerphase平台期荧光基团荧光检测元件*荧光定量PCR原理--荧光阈值*Cycle(循环数)Rn(荧光强度)BaselineLg-linerphase平台期前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline)荧光阈值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值;进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold*荧光定量PCR原理--Ct值*Cycle(循环数)Rn(荧光强度)Ct值的定义:PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Ctvalue*荧光定量PCR原理--Ct值的重现性*横轴:PCR反映循环数纵轴:荧光信号量Ct值的特点:相同模板进行96次扩增,终点处产物量不恒定;Ct值极具重现性*荧光定量PCR原理--Ct值定量的数学原理*理想的PCR反应Xn=X02n*Xn:第n次循环后扩增产物数量X0:起始模板数量n:扩增循环数*荧光定量PCR原理--Ct值定量的数学原理*非理想的PCR反应Xn=X0(1+En)n*Xn:第n次循环后扩增产物数量X0:起始模板数量n:扩增循环数En:扩增效率*