注意的是麋蛋白酶,其蛋白脱除率却只有19.8%,是五种蛋白酶中蛋白脱除率最差的,但它的精制效果仅次于木瓜蛋白酶,这种现象侧面说明了白芨多糖中,蛋白及其缀合物存在多样性。Р2.木瓜蛋白酶酶解条件研究Р木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶,主要作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸羧基参与形成的肽键,具有较宽的底物特异性,对底物特异性要求不严格,因而对多糖成分中的杂蛋白脱除效果较好。实验选择木瓜蛋白酶,进一步研究白芨多糖胶的酶法精制,重点考察加酶量、处理温度、溶液pH及处理时间对精制效果的影响。Р图1.1. 加酶量对酶法精制效果的影响Р在2%的白芨粗多糖溶液中,分别加入不同质量的木瓜蛋白酶,在pH7.0,温度50℃条件下处理180min。结果表明(图1.1),随着酶浓度提高,多糖纯度呈上升趋势,当酶用量大于10mg/g底物时,精制后多糖纯度大于90%,此时蛋白脱除率也在40%以上。进一步增加酶用量,脱除率增加有限,因而8~10mg/g底物的用量较为适宜。Р50℃下酶处理180min后的白芨多糖纯度在88%左右,但其余组也在83%以上,因而酶处理温度对精制效果影响不大。但考虑到在较高的处理温度下,白芨多糖粘度损失较大,因而从提高产物稳定性角度考虑,适宜的处理温度应选择45~50℃。Р图1.2 温度对酶法精制效果的影响Р天然白芨多糖胶溶液呈偏酸性,pH范围在5.0~6.0之间,这也是木瓜酶的适宜pH范围。但实验发现,在体系pH呈弱碱性时,精制效果更佳,其多糖纯度、脱蛋白率均优于弱酸性体系(图1.3)。体系pH既影响水解酶的反应活性,也影响反应底物的解离和空间构象,由于白芨粗多糖中的杂蛋白,结合了较多的非糖类成分,这些物质在不同pH下的解离和变构存在差别,使酶促反应受到影响。实验表明,采用木瓜酶对白芨粗多糖进行精制,其适宜pH为7.0~7.5。Р图1.3 pH对酶法精制效果的影响
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