单个细胞分离技术PBMC PPT课件

?内含血小板Р分离液?粒细胞?红细胞Р用细长吸管慢慢插入白膜层,沿管壁周边轻轻吸取单核细胞层于另一试管内加入PBS洗液3-4ml,离心洗涤2次,1500/r,10min. 弃去上清,留约50μl.加含有10%灭活小牛血清-PBS液1.0ml,混匀充池,镜下计数。Р单个核细胞Р2000rpm/ 20-30minР肝素抗凝血2ml +Hank’s液2ml液稀释а沿管壁缓慢加入到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中(不能破坏二者的液面),2000r/min 离心20minР 吸出淋巴细胞层加入另一试管中,加3~4ml Hank’s液,混匀离心洗涤, 1500r/min 离心10minР 弃去上清,再加3ml Hank’s液,混匀, 1500r/min 10min,重复洗涤2次重复1次? ? 末次离心后,弃去上清液。加含10%灭活小牛血清/HanK‘s液? 加至1.0ml,混匀,灌入血细胞计数池,单个核细胞计数,? 于低倍镜下计数4个角大格内细胞总数。Р方法Р留取约50μl,加缓冲液至1.0ml,稀释20倍Р计数细胞方法Р加样:?将淋巴细胞悬液混匀,吸取10μl加入到 40μl含10%灭活小牛?血清的Hank’s液中,混匀后再吸取10μl充入计数板上。?细胞悬液稀释5倍。此稀释也可省略,可根据细胞密度而定?静置片刻,置显微镜下计算淋巴细胞数。?具体计数方法如下:Р▲血细胞计数池的构造Р血细胞计数池的构造参数 4种方格的体积(容积)? ? 计数池区域边长(mm) 面积(mm2) 池深(mm) 体积(mm3 ul)Р 一个计数全池 3 9 0.10 0.90Р 大方格 1 1 0.10 0.10Р 白细胞中方格 0.25 0.0625 0.10 0.00625Р 红细胞中方格 0.20 0.0400 0.10 0.00400Р 红细胞小方格 0.05 0.0025 0.10 0.00025