使用GenBankР2Р根据原则筛选引物Р4Р引物设计的目的Р目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计。Р引物设计的原理Р1、择合适的靶序列:设计引物之前,必须分析待测靶序列的性质,选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。 ?2、长度:一般来说,寡核苷酸引物长度为 15~30bp。 ?3、 Tm 值:引物的 Tm 值一般控制在 55~60℃,尽可能保证上下游引物的 Tm 值一致,一般不超过 2℃。 ?4、(G+C)含量:有效引物中(G+C)的比例一般为 40~60%。 ?5、碱基的随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的,不存在聚嘌呤和聚嘧啶,尤其在引物的 3’端不应超过 3 个连续的 G 或 C。 ?6、引物自身:引物自身不存在连续 4 个碱基以上的互补序列,否则会影响到引物与模板之间的复性结合,尤其避免 3’末端的互补。Р引物的设计原则(详见课本P.164)Р①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。?②产物不能形成二级结构。?③引物长度一般在15~30碱基之间。?④ G+C含量在40%~60%之间。?⑤碱基要随机分布。?⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。?⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。?⑧引物5′端可以修饰。?⑨引物3′端不可修饰。?⑩引物3′端要避开密码子的第3位。РGenBank 是一个有来自于70,000多种生物的核苷酸序列的数据库。每条纪录都有编码区(CDS)特征的注释,还包括氨基酸的翻译。GenBank属于一个序列数据库的国际合作组织,包括EMBL和DDBJ。可使用它找到靶序列。Р1.从.gov/ore/网站中对该基因进行搜索,输入登录号:AK135903.1Р2.查询可知其序列为
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