中国人肥胖基因大肠杆菌中表达

OEX HTa 质粒(图1)。pPROEX HTa重组质粒转化大肠杆菌(E.coli) DH5α菌株并经酶切电泳鉴定。接种重组质粒的单菌落于3 ml LB中,37℃振摇培养过夜,按1%比例转接至30 ml LB中,37℃振摇培养3小时,使OD600约等于0.3~0.4,加入IPTG至终浓度为0.4mol/L,继续培养3小时,离心收集菌体,进行SDS-PAGE电泳。Р示意图Р将肥胖基因克隆入pPROEX HTa六聚组氨酸融合表达载体,获得表达的蛋白分子量为17.5 Kd,表达量高达20%左右。?用所得的瘦蛋白可以进一步研究瘦素作用机制及治疗肥胖症和糖尿病。Р最后结果Р特别说明Р在有些研究肥胖基因在大肠杆菌表达中,肥胖基因可在不同大肠杆菌、不同oD600值、不同时间诱导等条件下表达,从而可以研究外源基因在大肠杆菌中的表达量的效率。Р实验中我们曾分别用随机引物和P2引物来进行RNA反转录,结果后者的PCR得率要高得多。测序结果表明运用RT-PCR方法从中国人脂肪组织获得的肥胖基因序列与Friedman实验组报道的白种人完全一致,可见该基因在人种间可能没有差异,属于高度保守序列,在功能上有极其重要的作用。?对肥胖基因的原核表达,起初我们将肥胖基因克隆入pBL220原核表达载体,但未获得表达。后将其克隆入pPROEX HTa六聚组氨酸融合表达载体,结果获得了高效表达。运用该融合表达载体并可给产物纯化工作带来便利,只须用相应的亲和层析系统即可达到高质量的纯化。?我们成功完成了中国人肥胖基因的克隆,并通过核苷酸顺序分析证明中国人肥胖基因和已报道的白种人DNA顺序完全一致。我们得到的基因可用作探针,用于研究肥胖基因在肥胖症和糖尿病等病人中的表达情况。通过将肥胖基因克隆入原核表达载体,在大肠杆菌中表达,所得的重组瘦素可用于肥胖症和糖尿病的治疗研究,也可进一步探讨肥胖基因的作用机制。Р结果讨论