对自如,又必须透彻理解每一步实验流程所涉及的实验原理。? ——第一版前言(p11)?《分子克隆实验指南》第二版,1996,科学出版社Р4Р汇报内容Р1 表达载体的分类?2 目的基因的获得?3 酶切?4 片段回收?5 连接?6 质粒的检测Р5Р如何阅读质粒图谱Р1、质粒类型和大小(真核/原核/穿梭质粒)?2、复制起点(ori)?3、筛选标记(抗生素标记)?4、多克隆位点(MCS)?5、外源DNA片段的插入(位置、大小、酶切位点)?6、表达系统元件? (启动子—核糖体结合位点/内含子—克隆位点—转录终止信号)Р6Р7Р8Р1、杀菌机理:?四环素(tet): 四环素与核糖体30S亚基结合,抑制核糖体的转位。? Tet 抗性基因编码一个399的膜结合蛋白,可阻止四环素进入细胞。?氨苄青霉素(amp):氨苄青霉素可与细菌膜上一些与细胞壁合成有关的酶结合? 并抑制其活性。Amp基因可降解氨苄青霉素。?氯霉素(Cm或cat):氯霉素与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质的合成。? Cat 基因编码一个四聚体细胞蛋白,催化氯霉素羟乙酰氧衍生物的形成。?卡那霉素(kan):可与核糖体结合,抑制蛋白的合成。? 卡那霉素可被氨基糖苷磷酸转移酶(APH-II)灭活。?2、溶液配制:? 一般配成50或100mg/mL,抽滤,-20℃保存备用。Р常用抗生素抗性基因Р9Р遗传转化所用载体(1)Р一、基因枪转化? 1、对载体类型无选择;? 2、载体不宜过大,目的基因不宜过大。? 3、可以转化“启动子-目的基因-终止子”片段。?二、农杆菌转化? 1、农杆菌载体,含有左右边界;? 2、可以转化大的目的基因。Р10Р候选基因功能分析Р一、超表达载体? 1、CaMV 35S启动子;? 2、玉米Ubi启动子;? 3、其它。?二、RNAi载体? 1、含有intron,转录后形成发卡,沉默效率高;? 2、多用其本身启动子。
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