,加入Laemmli样品缓冲液并经含1mg/mL明胶的SDS-PAGE(分离胶10%)o电泳结束后,加入含2.5%Triton-X-100复性液孵育30min以去除SDS。随后将凝胶用50mmol/LHCKpH7.4),5mmol/LCaC12和1nmol/LZnC12于37°C下孵育过夜。加入0.05%考马斯亮蓝R-250室温染色30min,去离子水脱色,拍照,灰度扫描。1.5Rael活性检测裂解处理后的NCI-H292细胞,根据Cytoskeleton公司生产的G-LISATMActivationAssay试剂盒的操作说明测量Rael的活性。本试剂盒采用ELISA原理测量小G蛋白中结合GTP(活性形式)的含量而加以确定。测量组荧光强度/对照组强度的比值即为Rael的相对活性。1.6ROS检测NCI-H292细胞刺激结束后,加入10UMCM-H2DCFDA用于检测自由基的活性。荧光强度采用荧光分光光度计(HitachiF-2000)进行分析,其中激发波长为488nm,发射波长为530nmoROS含量根据标本荧光强度/对照品荧光强度的比值表示。1.7ELISA检测MUC5AC的产生采用酶联免疫分析测量MUC5AC蛋白的含量。细胞处理结束后,弃上清,随后用QCPBS洗涤细胞。并加入裂解缓冲液(20mMTris-HCl,133mMNaCl,1%NP-40及10%甘油)裂解细胞。离心获取裂解上清液并测定其浓度后置于-80°Co检测MUC5AC时,取裂解上清液置于96孔板中,40°C下烘干。加入2%胎牛血清于371封闭1h,随后加入含0.05%Tween-20的MUC5AC抗体(PBS稀释)孵育1h,结束后加入二抗,37°C1hoTMB法显色后,再加入2NH2S04终止反应。酶标仪下读取450nm下的吸光度。?1.8统计学分析计量资料以(x土s)表示。计量资料采用t检验。t检验。P
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