)构建端粒酶TERT的蛋白相互作用网络:端粒酶是多蛋白复合体。端粒酶的作用受到多个端粒结合蛋白以及端粒酶全酶(holoenzyme)中的多个辅助因子的调节。恶性肿瘤细胞普遍表达TERT并具有很高的端粒酶活性,我们拟以TERT为核心,运用BiFC等蛋白质组学技术,系统地筛选和鉴定肿瘤细胞中与TERT相互作用的蛋白,寻找端粒酶中其他尚未发现的重要组分。结合我们用酵母双杂交技术筛选出的与TERT相互作用的蛋白数据,经GST沉淀等方式确认其相互作用关系,用BiFC进一步研究关键TERT结合蛋白(如hnRNPA1)的相互作用,以及其对端粒长度的调控。(3)端粒相关蛋白对端粒DNA3’G链悬突(overhang)产生和端粒酶延伸端粒DNA的调节机制:我们将分析鉴定新的端粒酶和端粒体结合蛋白在对端粒overhang的产生和调节作用。我们创建和发展的独特方法可以准确地测定端粒overhang长度。细胞内端粒酶有两种延伸模式:进行性(processive)和分步性(distributive)。我们将利用现有的实验平台研究端粒酶调节端粒延伸的分子机理,定量地分析在单个细胞周期内端粒酶对细胞内端粒的延伸情况,进而分析新发现的端粒相关蛋白如何影响细胞内端粒酶的作用,丰富端粒酶活性调节的蛋白网络。(4)对新发现的端粒相关蛋白复合体进行结构研究:选择3-4个新发现的关键的端粒相关蛋白,对蛋白-端粒DNA或蛋白-蛋白复合物进行结晶实验,获得高质量晶体,解析复合物的三维结构。根据结构分析,对参与特异性相互作用的重要氨基酸突变来验证晶体结构并作功能分析。利用解析的结构信息,在数据库中搜索具有同源结构的蛋白,结合制作模型的方法和通过信息学手段,研究新蛋白与端粒结合蛋白可能的作用方式。对于难以结晶或存在较高程度无规则结构的复合物晶体作异核二维NMR光谱分析,研究其构象及其与端粒DNA、端粒体或端粒酶的相互作用。
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