50 mmol/L pH8.2 Tris—HCl,然后加入25℃预热过的邻苯三酚溶液10ul,迅速摇匀,倒入光径1 cm的比色杯内,用10 nmol/LHCl作空白,325 nm波长下每隔30 s测光吸收值一次,整个操作在4 min内完成,计算出每分钟A325的增值,此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率控制在0. 070(OD值)/min左右。Р 2.4.2酶活力测定Р 操作与上面基本一致,加入邻苯三酚前,先加入SOD样液10ul,测其光吸收值控制其自氧化速率在35%~65%,计算加酶后邻苯三酚自氧化率。Р 2.4.3酶活性单位的计算Р 根据酶活性单位的定义,按下列公式计算酶活性:Р SOD活力(U/ml)=MР 式中,A0:为邻苯三酚自氧化率:Р AM:加酶后邻苯三酚自氧化率;Р V总:反应总体积;Р V样:加入样品液的体积;Р V定义:活性单位定义体积1 ml;Р M:样品稀释倍数。Р 样品SOD比活力(U/mg)=单位体积活力(U/ml )/CР 式中,C:每ml样品液蛋白质含量(mg)。Р SOD总活性(U)=单位活性×酶原液总体积。Р 2.5 SOD纯度鉴定Р 2.5.1样品制备Р 取一定体积酶液,按酶液:40%蔗糖=1:1(体积比)的比例配成样品液,备用。Р 2.5.2凝胶的制备Р 表2 胶制备加量表Р 2.5.3加样及电泳Р 将电泳槽注满电极缓冲液,分别在各样品槽中加10 ~20ul样品液。在上槽加入少量0. 025%溴酚蓝溶液作指示剂,接通电源(样品侧为负极),调电压至150v电泳,待样品全部进胶后,调电压至200 V,至示踪染料下行距胶底1cm处停止电泳,取出玻璃板。Р 2.5.4显色与脱色Р 轻轻揭去一块玻璃板,另一板上的凝胶胶面朝下,再启胶一角注水,使胶缓缓落入培养皿中。将电泳后的凝胶在染料中浸泡2h,再放在脱色液中脱色,观察结果,拍照绘制模式图。
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