0.5ml/L NaOH溶液浸泡1h以上,抽干(可用布氏漏斗),用无离子水漂洗,使pH至8左右(用pH试纸检查)。再改用0.5ml/L HClР溶液浸泡1h以上,去酸溶液,用无离子水洗至pH6左右。然后用0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲液,浸泡平衡后使用。Р2.装柱Р用0.0175mol/L,pH6.7,磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE-纤维素,并更换1~2次。然后搅拌均匀,灌入层析柱中,直至纤维素柱床高约17cm左右为止。柱床形成后,在洗脱瓶装入0.0175mol/L pH6.7磷酸盐缓冲溶液,接在层析柱上口,打开柱下端出口,使磷酸盐缓冲溶液流过纤维素,直至流出液的pH值与磷酸盐缓冲溶液的pH值完全相同(用pH试纸不断检查)为止。Р3.上样Р上述平衡过程完毕后,关闭柱下口。用滴管吸去纤维素柱面上的深液(但不能低于柱下口),控制流速使样品慢慢进入纤维素内。待全部样品进入柱后,在柱床面上加一层0.0175mol/L pH6.7 磷酸盐缓冲溶液。Р4.洗脱Р 连接洗脱瓶,打开柱下口开始洗脱。控制流速为0.5ml/min, 用试管收集洗脱液,每管10滴。从每滴中取1滴收集液放入在黑色比色盘孔中,加入1滴20%磺基水杨酸检查是否产生白色沉淀。在此条件下在收集液中首先出现的蛋白质即为纯化的IgG。因此,从洗脱开始就应收集洗脱液,直至收集液中无蛋白质出现为止(加磺酰水杨酸不呈白色沉淀),合并含有蛋白质的各管收集液中无蛋白质即为纯化的IgG溶液。Р5.再生Р用过的离子交换剂可以反复使用,使其恢复原状的方法俗称“再生”。由于DEAE-纤维素使用后因带有大量杂蛋白,所以再生时,先用0.5ml/L NaOH浸洗,用无离子洗至pH8左右,然后用0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型再使用。Р6.鉴定Р纯化后获得的蛋白质样品均应进行鉴定后方能证明产品的合格性。
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