续进样 5 次,计算各氨基酸的回收率, 20 种氨基酸的平均回收率范围是 95.9 ~ 102.4% , rsd<3.8%(n=5) 。 2.3 重现性试验取 2.1 项下用于色谱分离的对照品溶液,按上述操作程序连续进样 6 次,对方法的重现性进行考察。结果表明, 20 种氨基酸的 rsd 为 0.08% ~ 3.82%(n=6) 。 2.4 样品氨基酸含量测定精密称取细胞培养基 m199 约 10g ,按说明书要求配制成溶液,即为供试品溶液。根据上述色谱条件进行分离分析,经系统适用性实验各氨基酸之间的分离度应大于 1.0 ,以天门冬氨酸计算,理论塔板数应大于 3000 ,采用外标法,将对照品溶液和供试品溶液分别注入色谱仪中。根据对照品溶液的浓度、峰面积和供试品溶液的峰面积,计算供试品中氨基酸的含量。结果各氨基酸组分的含量均在标示量的 80% ~ 100% 之间。 2.5 讨论本方法使用了两种衍生化试剂,可迅速衍生一级、二级氨基酸,使所有 20 种氨基酸均生成较强荧光和紫外吸收衍生物。自动进样器的使用,方便了衍生化步骤的操作。我们在进样时设置自动混匀程序,在抽取 opa 后自动混合 20 次,抽取 fmoc 后自动混合 30 次,衍生化反应完全,分析效率大为提高,也减少了误差的产生。脯氨酸的最大吸收波长在 262nm ,在 338nm 处灵敏度较低,因此, 我们设定在其他 19 个氨基酸出峰后切换波长为 262nm 以提高脯氨酸检测灵敏度。进行梯度洗脱,加快了氨基酸出峰时间,但应注意的是两种流动相的 ph 需要严格控制在 7.20 ,否则组氨酸与甘氨酸两峰易粘连,使检测误差加大。细胞培养基的型号较多,含有的氨基酸种类及质量均不相同,我们选取含氨基酸种类最多的 m199 作为试验对象,通过对 m199 中氨基酸含量检测方法的建立,也可适用于其他细胞培养基中氨基酸的检测。
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