:(1 )平末端的 DNA 片段两端接街头或衔接物;(2 )载体补平再连接。 2. 叙述 pUC18/19 载体可进行蓝白斑筛选的原理。答案要点:在 IPTG 诱导下, 载体上 LacZ ’基因表达的 beta 半乳糖苷酶的氨基端肽段与宿主表达的羧基端肽段实现 alpha 互补,形成有活性的 beta 半乳糖苷酶,该酶可降解 X-Gal ,形成蓝色产物, 因此转化子呈蓝色。如果由于外源基因的插入破坏了 LacZ ’基因, 则不能形成有活性的 beta 半乳糖苷酶,转化子呈白色。 3. 假设人类细胞中某一蛋白质的功能及其氨基酸序列是已知的, 试叙述克隆其编码基因的方法。答案要点:根据氨基酸序列合成核苷酸探针或设计 PCR 简并引物,构建 cDNA 文库进行筛选;或者利用相应的抗体从 cDNA 表达文库中筛选相应地克隆。 4. 试叙述菌落原位杂交鉴定目的基因的原理和基本步骤。答案要点:(1) 原理: 将转化平板上的重组菌落原位转移到固相载体上, 然后利用标记探针与载体杂交, 根据杂交位点在原始平板上找到目标克隆。(2) 步骤: 制备目的基因的标记探针, 将转化平板上的菌落一一对应转印到硝酸纤维素膜上, 保留原初平板, 对膜上的菌落进行碱变性, 中和, 用缓冲液洗去细胞碎片, 烤干或紫外照射将 DNA 交联到膜上, 在缓冲液中膜与探针杂交,洗去未杂交上的探针,放射自显影,返回平板挑取阳性菌落。 5. 利用大肠杆菌表达外源基因时,为什么以及如何将外源蛋白分泌到周质空间? 答案要点:(1 )周质空间蛋白酶少;呈氧化性,利于形成二硫键;(3 )具有折叠酶;(4)减少蛋白产物对细胞的毒性;(5 )方法:接上信号肽。 6. 大肠杆菌表达外源基因时, 常常会形成包涵体。可采取什么措施避免或减少包涵体的形成? 答案要点:(1 )降低培养温度;(2 )利用分子伴侣和折叠酶;(3 )利用融和蛋白。
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