用 PCR 扩增的单拷贝序列)。将获得的目的基因的 cDNA 克隆,进行测序, 确定两端的 cDNA 序列,约 200bp , 设计合成引物,并分别利用 cDNA 和基因组 DNA 作模板扩增; 比较并纯化特异带;利用 ST S 制备放射性探针与基因组进行原位杂交,使每隔 100kb 就有一个标志;二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段:首先是构建数百 kb的 YAC( 酵母人工染色体) ,对 YAC 进行作图,得到重叠的 YAC 连续克隆系,被称为低精度物理作图,然后在几十个 kb的 DNA 片段水平上进行,将 YAC 随机切割后装入粘粒的作图称为高精度物理作图。遗传图表现得是通过连锁分析确定的各基因间的相对位置;物理图表现的是染色体上每个 DNA 片段的实际顺序。 20. 什么是图位克隆? 图位克隆(Map - based cloning) 又称定位克隆(positional cloning) , 1986 年首先由剑桥大学的 Alan coulson 提出。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的, 无需预先知道基因的 DNA 顺序, 也无需预先知道其表达产物的有关信息, 但应有以下两方面的基本情况: 一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体,如F、 DH 、 BC 、 RI等。二是开展以下几项工作: 1) 首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记; 2) 用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置; 3) 构建含有大插入片段的基因组文库(BAC 库或 YAC) ; 4) 以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库; 5) 用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群; 6) 通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆; 7) 通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆; 8) 通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。
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