高分辨率荧光显微镜的基本原理和操作要求Р一、荧光显微镜(fluorescence microscope)? 原理: 某些物质经一定波长的光(如紫外光)照射后,物质中的分子被激活,吸收能量后跃迁至激发态;当其从激发态返回到基态时,所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外,其余较大部分则以光能形式辐射出来,由于能量没能全以光的形式辐射出来,故所辐射出的光的波长比激发光的要长,这种波长长于激发光的可见光部就是荧光(fluorescence)。所谓荧光就是某些物质在一定波长光(如紫外光)的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。Р二、荧光显微镜的组成?1、光源:一般采用高压汞灯?2、滤色系统:由激发滤板和压制滤板组成?a、激发滤板:提供一定范围的激发光?b、压制滤板:完全阻挡激发光通过,提供相应滤长范围荧光?3、反光镜:一般采用平面反光镜?4、聚光镜:用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成?5、物镜和目镜Р三、荧光显微镜的操作Р(1)安装紫外防护罩。? (2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。? (3)插入挡光板,中断光路。? (4)预热5—10分钟。? (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。? (6)选择接物镜(按照先低倍,后高倍顺序)。Р(7)旋转分光镜组件转盘,选择所需要的分光镜组件:“O”为观察透射光时用;“WU”为观察蓝色荧光时用(如DAPl);“WB”为观察绿色荧光时用(如FITC);“WG"为观察红色荧光时用(如TRITC)。? (8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜)。? (9)通过粗、细螺旋调整焦距。? (10)打开与显微镜连接的计算机,点击数码成像系统软件,采集数码图像。
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