或组织内未灭活内源性酶第三节免疫组织化学双重染色需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存。 1. 条件: 不同种属来源的特异性抗体双重染色; 两种抗原最好在不同部位; 两种抗体的抗原修复方法一致; 应用两种不同的显色系统或不同颜色的荧光( HRP 和 AP 或 FITC 和 TRITC) 。 2. 与单染不同点: (1) 在第一种抗原显色后,加双标阻断液或 0.05% 盐酸, RT , 10 min (2) 滴加非免疫血清( 与二抗同种属) 37℃,10 分钟。( 不洗) 接着加入第二种一抗 37℃孵育, 30 min 或4℃过夜; 重复以前的步骤。( 注意: 二抗的种属性, 复合物中酶不同) 免疫荧光组织化学 1 荧光原理介绍光: 由发光体质点的热运动所引起的辐射。光的波动性光的量子性物质经光照射后的两种表现形式 1 )荧光素 2 )非荧光素虑片荧光的分类: 荧光( Fluorescence ): 当某种物质经一定波长的入射光照射,吸收光能后进入激发状态, 并立即退激发, 释放出比入射光波长要长的出射光, 称为荧光。荧光为非温度辐射,是一种光致发光的冷发光现象。 1 原发性荧光:1 光致荧光(激发光通常紫外线、激光) 2 放射荧光 3 化学荧光 4 生物荧光 2 组织自发性荧光 3 继发性荧光 4 免疫荧光 1.2 荧光的本质?引发荧光最有效的光线是光谱上较短的区域:即紫外线区域,波长为 320~400nm. ?这种现象的实质是荧光素吸收了短波光的能量( 波长越短, 光能越强), 又以发光的形式以波长较长的荧光射出,而为人眼所见。 1.3 荧光素特性荧光效率(fluorescence efficiency) : 荧光素吸收光后发射出的荧光量子数与其所吸收激发光量子术的比值。通常小于 1 ,其值应在 0.35 以上。荧光效率= 发出荧光光子数/ 吸收光子数
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