这样的实验系统的建立对基础研究和高新技术研究均有重大意义。因此,把离体受精的成功看作植物受精研究史中的重要里程碑是没有夸张的。Р植物离体受精成功的技术基础是:Р1. 植物雌、雄性细胞的分离Р2. 植物雌、雄性细胞离体融合Р3. 合子培养和新植株生成Р1.1花粉原生质体与脱外壁花粉的分离? 花粉粒被花粉外壁与内壁所包围,用人工方法脱去外壁和内壁,可分离出仅有质膜保护的花粉原生质体;仅脱去外壁,保留了内壁与原生质体的结构单位,可称之为“脱外壁花粉”(de-exined pollen)。Р1.1.1花粉原生质体的分离Р花粉原生质体兼有花粉与单倍性原生质体双重特性,具有重大研究价值。上世纪80年代中后期,探索出了三条分离花粉原生质体的路线:? 1.化学脱壁。用氧化剂、酸、碱、多糖试剂等多种化学试剂处理花粉外壁,但易导致原生质体受损。? 2.非酶法脱壁。据报道,用NaCl溶液滴加菜豆成熟花粉,能迅速释放出原生质体,但并未提供脱壁是否彻底的证据。? 3.酶法脱壁。根据不同植物花粉的特点,使用酶降解外壁,这是目前唯一行之有效的路线。Р花粉原生质体的酶解脱壁与体细胞原生质体分离时直接降解是不同的。? 花粉壁包括外壁和内壁。外壁的基本成分是孢粉素,是类胡萝卜素与类胡萝卜素酯的氧化多聚化的衍生物,性质十分坚固,至今尚无酶能加以降解。内壁的基本成分是纤维素与果胶质,可为常规细胞壁降解酶分解。可见,外壁是分离花粉原生质体的主要障碍。因此需避开外壁,降解内壁,促使原生质体分离。Р目前大致有四种分离方法:?1. 一步酶解法。该法适用于具宽大萌发沟花粉的植物。花粉置于酶液中,通过水合膨胀,使外壁沿萌发沟裂开,内壁大面积暴露,在酶作用下分解,释放出原生质体。?2. 水合—酶解二步法。在上述工作基础上,将水合与酶解分成二个步骤。第一步花粉在溶液中充分水合,使外壁裂开。第二步转入酶液,降解内壁,获得原生质体。
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