obel化学奖。Р1. M13 DNA进行的寡核苷酸介导诱变Р(1)条件Р①所要改变的基因编码区的精确的核苷酸序列。Р②所要引入的氨基酸变化。Р(2)方法Р①取得目的基因。РGGCTTAРCCGAATР5’Р5’Р3’Р3’Р②插入到双链形式的M13噬菌体载体中Р③分离出M13正链重组载体РGGCTTAРCCGAAT?GGCTTAР④合成带有突变核苷酸的目的基因寡核苷酸片段РCCGAAGР5’Р3’Р⑤带有突变核苷酸的寡核苷酸片段与M13(+)链复性。Р错配的核苷酸位于片段的中部,以利于复性杂交。РGGCTTAРCCGAAР5’Р3’РGР⑥以寡核苷酸链作引物,以M13(+)作模板,用Klenow片段合成M13(-)链。РGGCTTAРGРCCGAAР5’Р3’Р⑦用T4DNA连接酶连接结成完整的双链РGGCTTAРCCGAAGР⑧转化大肠杆菌,噬菌体DNA在大肠杆菌中扩增,形成一半野生型M13双链DNA,一半突变型M13双链DNA噬菌体。Р野生型РCCGAAGР诱变型РGGCTTCРGGCTTAРCCGAATР(M13的复制型是双链环状DNA)。Р母链Р(3)缺点:Р⑨分离提取M13双链DNA,再转化大肠杆菌,用寡聚核苷酸探针挑选突变型载体克隆。Р⑩切下突变基因,接到表达载体中表达诱变的蛋白质。Р通常只有1%-5%的噬菌斑含有突变的基因。Р(4)改进:Р目的基因插入双链形式的M13噬菌体后,转入特殊的受体菌株中。Р2. 寡核苷酸介导的PCR诱变Р(1)方法Р①将目的基因克隆到质粒上。Р②在欲突变的位置上设计两对引物,分别带有两条链的突变核苷酸。РATGCATGCATGCATGCРTACGTACGTACGTACGРATGAATGCATGCРTACGРATGCATGCATGCATGCРTACGTACGTACGTACGРCATGCРTACGTACTTACРP1РP2РP3РP4
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