有不同的预处理方法。 1 .胞外酶的预处理和制备存在培养液中,只需将菌体过滤或离心去除,所得的清液即为粗酶液。如果是固态发酵麸曲,用水或缓冲液浸泡,再离心或过滤去菌体及杂物后所得清液即粗酶液。粗酶液再经提纯即酶精制品。 2 .胞内酶的预处理胞内酶需要破碎细胞壁和质膜,然后制成无细胞提取液, 再提纯。破碎细胞的方法有:干燥法: (空气干燥、真空冷冻干燥、溶剂脱水干燥)、机械法: (研磨法、机械捣碎)、超声波破碎、反复冷冻法、自溶法、溶菌酶法。(二) 酶的提取酶是比较脆弱的物质,处理不当容易变性,提取前要对目的酶的等电点、 pH、温度的稳定性、氧化还原剂对酶的影响有所了解。 1.水溶液提取法用稀的盐溶液、缓冲液或水提取。稀盐、缓冲溶液和水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取酶常用的溶剂,提取液的用量是培养液体积的1~5倍。在提取时要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。同时根据不同酶的性质控制好提取温度。多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,适当提高温度,但时间不宜过长, 需缩短提取时间。避免温度过高导致酶蛋白质变性失活,一般在 5℃以下操作。为了避免提取过程中酶被蛋白水解酶降解,可加入二异丙基氟磷酸和碘乙酸抑制蛋白水解酶活性。特别注意提取液的 pH和盐的浓度。(1)pH:酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时,防止过酸或过碱而引起酶蛋白可解离基团变化,而导致酶蛋白构象的不可逆变化。碱性酶用偏酸性的提取液提取,而酸性酶用偏碱性的提取液提取。(2)盐浓度:稀浓度盐溶液可促进酶蛋白的溶解度,同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护酶蛋白不易变性的优点, 在提取液中加入少量 NaCl (0.15mol/L )或其他中性盐。缓冲液常采用 0.02 ~0.05 mol/L 磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
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