min 至1 h 白质,可添加10 µg 和25 µg 的胰蛋白酶(10 至25 µL胰蛋白酶储备液)Р · 90 °C,20 min(亲水性蛋白质)至1 h(疏水性蛋白质) 4. 短暂涡旋Р 7. 冷却至室温 5. 将试管置于加热器中,在37 °C 下孵育4 至18 hР 6. 冷却溶液Р 烷基化Р 降低pH,终止胰蛋白酶活性Р 1. 加入4.0 µL IAM 储备液Р 2. 短暂涡旋Р 1. 加入1 µL 纯甲酸或TFA,降低pH 值,终止胰蛋白酶活性Р 在暗光(箔纸覆盖)、室温下孵育样品Р 3. 1 h 如果您打算脱盐,可选用TFA,有助于纯化过程中肽段与树脂的结合Р 2. 短暂涡旋Р 淬灭过量的IAMР 3. 如果您担心原始样品的pH,可检查其pH 值(典型值为3.0 至3.3)。Р 如果pH 值大于4,可添加更多的甲酸Р 1. 加入1.0 µL DTT 储备液,破坏多余的IAMР 2. 在暗光(箔纸覆盖)、室温下放置1 hР 酶解物纯化Р 稀释及pH 调节Р 1. 根据样品的来源,可能需要在质谱分析前进行脱盐Р 1. 添加300 µL 的水,稀释变性剂 2. 如果不需要脱盐,但是样品呈现不透明状,可在质谱分析前进行样品过滤。可使用Р 2. 加入100 µL 碳酸氢铵储备液以增加pH 安捷伦离心过滤器,部件号5185-5990不透明状可能是由于样品中的细胞碎屑所导致Р 3. 或者,也可以取0.5 至1 µL 溶液滴在pH 试纸上进行检测。典型值为7.5至8.0。更重要的 3. 必要时,可稀释一份样品用于分析Р 是,当起始样品的pH 未知时,需要检查pH 值如果蛋白质分子量为50 kDa,且酶解充分,溶液浓度约为20 pmol/µLР 4. 如果pH 不在7 到9 的范围内,则需加入更多碱(碳酸氢铵) 如果您的样品并不复杂,可稀释为50 fmol/µL 的溶液Р 11
全文预览
