构建重庆大学硕士学位论文 1绪论 5 a.多种响应元件MRE分子克隆,连接到pGL-3载体上; b.cAMP响应元件CRE分子克隆,连接到MRE/pGL-3上; c.血清响应元件SRE分子克隆,连接到MRE/CRE/pGL-3上; d.挑选克隆,测序。③GCG-R筛选细胞株与高通量筛选模型的建立 a.将GCG-R和MRE/CRE/SRE-LUC共转染到HEK293细胞、SH细胞、 CHO细胞和HELA细胞中; b.用G418筛选稳定细胞株; c.挑选最适用于GCG-R筛选的细胞株; d.优化各种筛选条件,建立稳定可靠的筛选方法。④天然产物提取物库的建立 a.从中医临床研究经验、中医药古籍文献、民间验方和秘方偏方中收集具有治疗2型糖尿病等功效的天然药物; b.以水、甲醇、乙醇和乙酸乙酯为溶剂,采用回流提取法和ASE200加速溶剂萃取法提取天然药物中的有效成分; c.以FlashmasterⅡ全自动分离纯化系统将提取物分离为各种结构相似的组分。⑤GCG-R拮抗剂的高通量筛选 a.96孔板培养细胞(过夜); b.每孔添加提取物样品,同时以空白、内源配体作对照,孵育6-8小时; c.每孔添加一定量的Bright-Glo Assay Substrate,用酶标仪测定天然产物提取物的荧光活性。 d.为了克服假阳性,拟采用阴性细胞株和其他受体细胞株作对照。在只对 GCG-R起作用、而不对阴性细胞株和其他细胞株起作用的样品中筛选活性提取物。 1.4创新性(1)GCG-R是胰高血糖素的受体,目前尚未见到GCG-R高通量筛选的报道。本文以此为靶标,在天然产物中筛选活性化合物,其成果将有助于GCG-R 及Glucagon生理功能研究以及治疗2型糖尿病药物的研发。(2)以G蛋白偶联受体为靶标,在天然产物提取物中筛选拮抗剂本身即为一种创新,其研究思路可成为天然产物资源研究及中药的现代化开发的新途径。
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