步提取的RNA溶液中吸取2ul,与98 ul去RNA酶水混合后,取出1 0ul于紫外分光光度计下检测OD260及OD280值,确定样本OD260/ OD280在1.8~2.0之间,证实RNA提取质量良好。Р(五)RNA浓度检测利用如下公式计算RNA浓度:РRNA浓度(ug/u1)=(OD260--OD320)×稀释倍数(50)×0.04Р(六)cDNA的合成按照mRNA反转录试剂盒使用说明书进行操作,反应体系如下: RNase Free H20?1 0ulР5×RT BUfI’er?4ulРdNTP Mixture?2ulРRNase Inhibitor?l ulРOligo(dT)20?1 ulРRNA?1 ulРRever Tra Ace?1 ulР反应条件为:42℃20min-'--99℃5min一4℃5min一瞬间离心。(七)CK.19mRNA荧光定量PCR检测Р1.引物序列: CK.19mRNA上游引物序列:5’.TGCGGGACAAGATT.3’ CK.1 9mRNA下游引物序列:5’.T.3’РTaqman荧光探针序列:?5’.T(AGGAn’G.3’РFAM作为荧光基团标记探针5’端,TAMRA作为淬灭基团标记探针3’端。 2.反应体系:包括逆转录产物31.tl,寡聚核苷酸引物各为400nmol/L,Р探针l 50nmol/L,dATP,dCTP和dGTP各2001amol/L,dUTP 400I_tmol/L,1 OР×缓冲液5ul,MgCl25mmol/L,Taq DNA聚合酶1.25 U,尿嘧啶N一糖基化酶(UNG)O.5 U。在荧光定量PCR仪上测定标准品和血液样品的 CKl 9mRNA以及GAPDH(内参,用以判定mRNA提取和cDNA合成效果) 的含量。Р3.扩增参数:50"C 1rain,1个循环_95℃3rain,1个循环_94℃30s,Р9
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