荧光染料,如Invitrogen公司用于测定双链DNA的PicoGreen、用于测定单链DNA的OliGreen及用于测定RNA含量的RiboGreen等。含这些染料的核酸定量试剂盒被认为是目前对微量核酸定量较准确的方法。与紫外分光光度法相比,荧光染料法的应用尚不广泛.它存在以下缺陷:某些荧光染料具有极强的毒性和致诱变性;荧光分析对环境因素极为敏感,易受温度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干扰;该法需制作标准曲线,操作较复杂;需专业的定量试剂盒,价格昂贵;精确定量需依赖已知浓度的标准物质,而目前缺乏经过精确定值的标准物质,且少数现今采用标准物质的定量方法为紫外分光光度法,这就产生潜在的偏差并使测量结果无法溯源到国际单位制。 PCR法 PCR电泳法 PCR技术检测简便快速、灵敏度高、特异性强、且扩增模式多样,常见的有套式PCR、竞争PCR及终点稀释法等。套式PCR通过嵌套引物的使用进一步增加了标准PCR的特异性和灵敏度。终点稀释法通过梯度稀释待检样本及分别PCR,直到扩增结果为阴性,依据稀释倍数计算起始靶基因的分子数。这种分析方法的优点是核酸的定量不依赖扩增效率,操作简便,灵敏度高。但每个样品需多次PCR反应,工作量大,且需获得稳定的PCR反应条件。无论是标准PCR还是改进的套式PCR、竞争PCR及终点稀释法,反应产物均需进行电泳,而电泳图谱只能通过对比明亮度达到相对定量,其检测灵敏度、特异性及定量准确性均较差,且易受多糖、蛋白等杂质及反应体系的影响。 PCR产物微孔板杂交法 PCR产物微孔板杂交法结合了PCR技术、核酸杂交技术及酶联免疫技术,该法具有以下突出优点:检测灵敏度高于琼脂糖凝胶电泳;显色反应类似酶联免疫检测,特异性强;仪器容易操作,稳定性好,数据读取客观;杂交过程短,可以同时大量检测;可实现PCR产物的定量或相对定量等。但该法操作步骤较繁琐,且放射性物质对人体有害。
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