核酸样品纯度评估:纯DNA的A260/A280比值为1.8,纯RNA为2.0。假如比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染,需要纯化样品。比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液Р3.A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。Р4.A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度,该值应该接近0.0。假如不是,标明溶液中有悬浮物,需要纯化样品。Р5.核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响。只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下(如10 mM Tris-HCl pH 8.0),才能得到精确的检测结果。水的pH值不稳定,可能导致检测误差。一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收,为了确保准确测量,请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。Р6.在DNA样品的测定中,一些平行测定的样品会表现出测定浓度的变化,其可能原因为:①DNA样品的A260 吸光度值是否>0.1。(请注重,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于0.1,其值才有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值<0.1);②待测样品是否经过了充分的混匀,这样才能保证测定值的均一;③待测样品中有相当含量的杂质。A260/A280和A260/A230是DNA纯度的指示值,纯度好的DNA,在pH7-8.5 下其比值应该在2.0 或2.5,A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度,A280是蛋白质的吸光度。Р7.A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中,需要降低样品的稀释度,A230的负值会被校正。同时需要注重的是A260 的读数也必需大于0.1 才能保证可靠的结果。
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