,冰上放置30分钟2.2.5连接产物的转化、筛选及PCR检测1.将10μlDNA的连接物加入一管感受态细胞中,混匀后放置冰上30分种;2.42℃水浴中热激恰恰90sec,迅速取出立即放于冰上2min,室温下放置3-5min;3.加入800ml37℃预热的LB液体培养基,混匀后37℃180rpm培养0.5h4.4000rpm离心10min,去800ml上清液,将剩余的200ml菌液混匀;5.用烧烤过的涂布棒将100ml的菌液涂布于加相应抗生素的LB固体培养基涂匀,共2个6.置于37℃恒温箱中培养2.2.6连接产物的筛选及PCR检测1.选取平板上合适菌落,标记备用(共4个)2.用10μl移液器枪头对准所选菌落刮取,置于装有1ml溶液的EP管中3.将EP管进行摇床培养4,PCR检测3.实验结果与分析3.1甘薯RNA的提取及检测+反转录图1-2总RNA的电泳图(末)图1-1总RNA的电泳图(初)结果分析:RNA极易被RNA酶降解,而RNA酶在自然界中广泛而丰富的存在,因此要取得本次实验的成功关键之处在于严格防止RNA酶的污染。此外,为了达到更佳的效果,实验选用的材料是甘薯嫩叶,因为其RNA含量丰富,但实验中能否研磨充分,也会对实验结果造成影响。从RNA电泳的结果来看,我们组在该次实验中较好地做到了这两点,因此获得的条带不仅区分度好,亮度也高。在实验中共进行了两次紫外检测,首次检测是在预期时间后,但发现RNA条带跑的不是很开(如图1-1),分析原因是配制琼脂糖凝胶时胶浓度比期望浓度大,致使RNA迁移速率减慢,因而电泳时间相对延长。由于在电场中核酸分子的迁移速率取决于分子量大小和空间构型,沉降系数大的RNA跑得慢,故从上到下的条带分别代表28S、18S、5.8S(如图1-2)。从电泳获得的28S和18S两条主带的亮度来看,28S和18SRNA比值约为2:1,符合一般真核细胞RNA比值。
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