reenPCRMasterMix10ul(TOYOBO)(使用前需振荡均匀)上游引物0.5ul(10uM)下游引物0.5ul(10uM)总体积15ul计算好实验中需用多少份体系,则按具体量配置。体系分装会有损失,一般多配0.5份--1份体系。总的体系配好后,在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀,然后15ul每管分装至8连管中。3.cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度,一般为1:20稀释,如遇到基因表达低的样品,则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后,即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕,盖好八连管盖,并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序(不可将标记写在反应管的盖子上,八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域,且保证每孔均盖紧,否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。)4.把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。五.上机:5.1先开电脑,进入Windows界面。接着打开PCR仪电源开关。5.2打开7500软件,选择“新建”,在“Template”下拉菜单中选择“60”或“65”(普通基因检测为“60”,MicroRNA检测为“65”)5.3打开样品架,放入八连管,关上样品架,并在软件上选择已放反应管的孔位,剔除无反应管的孔位。5.4点击File菜单中Save,输入要保存结果的文件名,命名为日期-上机时间-客户名字简写,如100830-1008-WL表示8月30日10点08分魏立的实验。5.5点击Start键,开始运行程序。5.6程序运行完毕后,取出样品架上的八连管,按顺序关闭ABIPRISM7500SDS软件、PCR仪电源开关。5.7在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称,分类保存好结果文件。反应完成后,八连管应装到封口袋中,袋子上标记好文件名,客户的名字。(同一个客户的三次重复实验,则只需保存其中一次重复的反应管即可,其余可丢弃)
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