过人为控制体外合成系统的温度,使? 1.双链DNA变成单链? 2.单链DNA与人工合成的引物退火? 3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。Р基本步骤? 变性:加热使双链DNA变为单链(94℃,30s)? 退火:降温使引物和互补模板在局部形成杂交链(55℃,30s)? 延伸:耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应(70~72℃,30~60s)Р示意图РReal-time定量PCR仪是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测和连续地分析整个PCR进程,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的分析。РSYBR GreenРSYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,只有和双链DNA结合后才发出荧光,DNA双链分开就不发出荧光,随PCR循环数的增加,产物量的增多,产生的荧光信号逐渐增强,实现了荧光信号与产物量的关联。Р理论上来说,PCR反应过程中生成的DNA产物是呈指数方式增加的,即每增加一个循环,PCR产物加倍。但随着反应循环数的增加,产物积累、原料消耗,最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增,而进入线性期和平台期。整个PCR反应过程中,只有在指数期,PCR产物的量与加入的初始模板量存在明确的数学关系(PCR产物量=初始模板量×2^N,N=循环数),因此,利用公式,可以由产物的量精确推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期,PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关系,由这两个时期的产物量来推算初始模板量的多少是不准确的。Р在相同的条件下,进行复制扩增,每扩增一个循环,通过检验荧光来检测每个孔里目标基因片段的含量,记录每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数(样本的域值循环数Ct),次数越多就说明目标基因在原本的样品里越少,即初始模板的量越少。
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