微镜观察结果。ab图3-10-8 a:直接法,IgG沿肾小球毛细血管袢分布;b:间接法,肾小球毛细血管袢内ApoE阳性(四)免疫酶标技术免疫酶标技术(immunoenzymatictechnique)是指用酶标记抗体或酶标记抗抗体进行的抗原抗体反应,其原理及操作程序与免疫荧光技术基本相似,差别在于用酶代替荧光素作为标记物,并以底物被酶分解后的显色深浅来反映组织中抗原或抗体的含量及位置,常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidese,HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosphatese,AKP),常用的显色剂有DAB(3,3-二氨基联苯胺)和AEC(3-氨基-9-乙基卡巴唑),前者为棕色(图3-10-9a),可长期保存,后者为红色(图3-10-9b),易于褪色。免疫酶技术用于正常和病理组织中,称为酶免疫组织化学技术。优点为:可用普通光学显微镜观察,酶标记抗体染色后,标本还可用其他染料复染,以显示细胞形态或细胞核,标本可长期保存。最常用的是过氧化物酶-抗过氧化物酶法,简称PAP法,此外还有生物素和亲和素(ABC)法。免疫酶标技术分为间接法和直接法,其原理同免疫荧光直接法和间接法[12]。下面分别介绍其步骤。ab图3-10-9 免疫酶标染色a:胰岛Amylin染色,DAB显色为棕色;b:肾组织Cytokeratin染色,AEC显色为红色1.直接法①标本固定,冰冻切片已干燥,可直接染色(如从低温冰箱取出的冰冻切片,须充分吹干),石蜡切片脱蜡、入水;②PBS洗涤2×3min;③3.1%H2O2(或1%H2O2甲醇)抑制内源性过氧化物,室温10~20min;④正常血清(1:10)孵育,室温20min;⑤滴加酶标记的抗体37℃1h或4℃过夜;⑥PBS洗涤3×3min;⑦DAB+H2O2显色5~10min,镜下控制染色结果。DAB+H2O2应用前15min配制
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