光测定Р在l7×75ram的硼酶玻璃管中,加入含有0.5/~g/ml滇乙锭的pH8.0的Tris缓冲液1.2ml和10#1 DNA一组蛋白复合物(其中古0.5Fg胸腺DNA 和1.5Fg完整组蛋白),于37oc平衡5分钟后,加入约lOIll蛋白酶,在一定的间隔时间内,测定荧光增量。激发波长为525nm,发射波长为600nm。l_2.2 间接荧光测定为了改善灵敏度,DNA一组蛋白的结合在500~l Eppendorf管中进行向Eppendor[管中加入1.2ml含0.5/~g/ml溴乙锭的pH8.0的=rrig缓冲液,10/~1 DNA一组蛋白混合液(含1_5 g组蛋白和0.5 g DNA),于37oc保温5分钟,充分混匀后,取样1O I加入荧光管中,再加入1O 蛋白酶混匀后,测定荧光增量。Р1_3 本方法的特点Р1_3.1灵敏度高,足以在纳克水平定量测定多种蛋白酶活性。如可检测1O个细胞提取液中的蛋白酶活性。Р1_3.2快速,适用于大量样品的测定。如蛋白酶分离纯化过程中,测定纯化中间产物的酶活性,血清中QI-抗胰蛋白酶活性等。Р1|3.3结果稳定,重复性好。组蛋白与DNA结合稳定,22oc 1O小时内都很稳定,且不受离子浓度和变性剂的影响,如150retoolNaCI、10retool MgC12和CaCI2及0.02SDS、0.04 十二烷基肌氨酸、2 Triton等对组蛋白与DNA的结合都无明显影响。此法还可同时测定蛋白酶抑制剂。Р2.FJA 法Р流动注射分析(Flow injection analysis,FlA)是近年发展起来的又一项应用广泛的分析测试新技木。FIA具有重复性好、反应迅速、省时、试剂消耗少、适应性广等特点,已广泛用于分析化学、生物化学、临床检验及食品分析等多种领域。目前.FIA在酶活性检测中也得到应用。下面介绍用荧光标记底物测定蛋白酶活性的FIA法。
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