向PCR反应管中加入超纯水、dNTPs、PCR缓冲液、正向引物、反向引物、Taq酶、模板DNA,低速离心后放入PCR仪,PCR反应程序为:94℃ 5 min;94℃ 15 s,58℃ 15 s,72℃ 15 s,35个循环;72℃ 10 min,4℃下保存。Р检测时同时设阴性对照和阳性对照。Р电泳及成像Р电泳Р将PCR产物5 µL与上样染料3 µL混合,加入1.5%琼脂糖凝胶的点样孔中,同时设100 bp梯度 DNA标准分子量作为片段大小的标准。100 V电压电泳约40 min。Р成像及分析Р将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察窗内,观察分析并成像保存。Р结果判定Р样品PCR扩增产物经凝胶成像系统观察,凝胶上阳性对照出现一条约220 bp大小的特异性条带,阴性对照没有该特异性条带;供试样品出现与阳性对照相同大小的特异性条带,样品为阳性,即带柑橘溃疡病菌;供试样品未出现与阳性对照相同大小的特异性条带,样品为阴性,即不带柑橘溃疡病菌。Р检测后样品的处理РDNA提取液放置于-20℃以下,以备复检。用于柑橘溃疡病菌检测的植物样品、用具,以及实验操作台面和废液在完成检验后,植物样品集中销毁,用具及废液进行灭活处理,实验操作台面用70%酒精杀菌。Р(资料性附录)Р柑橘溃疡病症状特征Р受害叶片开始于叶背出现黄色或黄绿色针头大小的油渍状斑点,继而在叶片两面逐渐隆起,成为近圆形、米黄色病斑,不久病部表皮破裂,呈海绵状,隆起显著,木栓化,表面粗糙,灰白色或灰褐色。随后病部中央凹陷并呈火山口状开裂,且有微细轮纹,周围有黄晕,病斑直径一般为3 mm~5 mm,有时几个病斑聚合呈不规则形大斑。枝梢受害以夏梢为重,病斑形状与叶上相似,但突起明显,周围无黄晕,严重时引起落叶、枯梢。果实上病斑与叶片相似,但病斑较大,木栓化程度比叶部更为坚实,火山口开裂更为显著。病斑限于果皮上,发生严重时引起早期落果。
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