min,冰浴5 min,然后依次加入RT缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、反转录酶,混匀并低速离心后放入PCR仪,42℃ 60 min,94℃ 5 min,立即冰浴(至少5 min)。РPCR扩增体系Р扩增体系见表2,体系总体积25µL/管。Р表2 柑橘衰退病毒PCR扩增体系Р检测试剂Р终浓度Р每管加入量/µLРcDNA第一链合成产物Р-Р5РPCR缓冲液[× 10]Р1×Р2.5Р正向引物[10 µM]Р0.5 μMР1.25Р反向引物[10 µM]Р0.5 μMР1Р无菌超纯水Р-Р15.05РTaq酶[5 U/µL]Р1 U/25µLР0.2Р总体积Р-Р25РPCR扩增Р按表2,依次向含5 µL cDNA第一链合成产物的PCR反应管中加入PCR缓冲液、正向引物、反向引物、超纯水及Taq酶,混匀后放入PCR仪,PCR反应程序为:94℃ 5 min;94℃ 30 s,54℃ 15 s,72℃ 40 s,35个循环;72℃ 10min,4℃下保存。Р检测时同时设阴性对照和阳性对照。Р电泳及成像Р电泳Р将PCR产物5 µL与上样染料3 µL混合,加入1.5%琼脂糖凝胶的点样孔中,同时设100 bp梯度 DNA标准分子量作为片段大小的标准。100 V电压电泳约40 min。Р成像及分析Р将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察窗内,观察分析并成像保存。Р结果判定Р样品RT-PCR扩增产物经凝胶成像系统观察,凝胶上阳性对照出现一条672 bp大小的特异性条带,阴性对照没有该特异性条带;供试样品出现与阳性对照相同大小的特异性条带,样品为阳性,即带柑橘衰退病毒;供试样品未出现与阳性对照相同大小的特异性条带,样品为阴性,即不带柑橘衰退病毒。Р检测后样品的处理Р总核酸提取液放置于-20℃以下,以备复检。用于柑橘衰退病毒检测的样品、用具在完成检验后,用具应进行灭活处理,样品集中销毁。
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