ChIP、RIP、RNA pull-down、EMSA、Luciferase原理

5 EMSA实验原理Р 5 Luciferase实验Р 荧光素酶(Luciferase)是自然界中能够产生生物发光的酶的统称,不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应。Р 萤光生成反应通常分为以下两步:Р 萤光素+ ATP→萤光素化腺苷酸(luciferyl adenylate)+ PPiР 萤光素化腺苷酸+ O2→氧萤光素+ AMP +光Р 荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中,将不同类型的细胞(骨髓干细胞、T细胞等)标记上(即表达)荧光素酶,就可以用高敏感度的РCCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光,而发出的光子可以被光敏感元件,如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。Р 图6 Luciferase研究增强子原理Р 图7 Luciferase常用载体Р 图8 Luciferase片段缺失分析实验流程Р 图9 Luciferase定点突变分析实验流程Р 荧光素酶分析可应用于启动子研究中分析顺式作用元件和反式作用因子、药物筛选、siRNA和miRNA筛选、分泌途径及蛋白定位报告基因检测、活细胞的实时动态研究、信号转导通路分析、难转染的细胞(包括干细胞和原代细胞)的研究、RNA剪接研究。Р 双荧光素酶报告基因测试,是结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术。在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速、灵敏、简便。其应用广泛,可同时分析多个调控元件、同时分析多个信号转导通路、单次筛选一个以上的靶点(包括脱靶效应、分析两个或多个通路之间的相互作用)。