mirRNA的定量实验方案

。在此步的同时要做内参 5sRNA 的逆转录 2. 反应体系如下: ( 分开进行,三组反应) HN RT- 657 HN RT- 1 88-3p R-5SrRNA 80℃变性 5分钟,然后迅速在冰上急冻 5分钟. 向反应管中加入: 42℃ 45min. 后 85℃ 5min 使得逆转录酶失活。(四) Real-time PCR 1.cDNA 稀释 10ul 水 10ul 水 10ul 水 10ul 水 10ul 水 RNA 2.0ul(0.1-1.0g) HN RT- X( 1uM) 1.0ul 2.5mMdNTP 2.0ul(Final 0.5mM) dH 2O2.0ul 5× RT Buffer 2.0ul RTase(100-200U/ul ) 1.0ul HN miR- X-F (1uM) 1.0ul HN miR- X -R (1uM) 1.0ul cDNA 2.0 ul 2xSyBGreen Mix 5.0 ul dH 2O 1.0 ul 10ul 样 40ul 水5 倍稀释 10 20 40 80 160 320 10ul 10ul 10ul 10ul 10ul 2. 稀释好的模板按如下体系进行加样: HN miR- 657-F F -5SrRNA HN miR -657-R R-5SrRNA HN- 188-3p-F HN -188-3p -R 注意:要用 5sRNA 做内参和水做阴性对照;做复孔; 10ul 水 10ul 3.要用到六排八连管,每三排为一组,分别测定 miR 188a -3p 和miR657 。样本做两排,做复孔,每一排的第一孔加水做阴性对照;前两排的其余七孔按照上图稀释的倍数按顺序加入不同稀释度的样本反应液;第三排的其余七孔加内参 5sRN A 的不同稀释度的反应液,同样的顺序。 95℃10min 95℃5s60℃10s 40-45 循环