长的小条? 切成1mm3的小块? 入盛有冷的固定液的小瓶中Р(2)体外培养细胞的取材:Р贴壁细胞需先用胰酶消化细胞Р低温/普通离心机,离心(2000r/min)15min? 弃培养液Р PBS洗3次?立即倾斜离心管,沿管壁缓缓加入戊二醛Р 置0~4℃冰箱Р【1】固定液的组成:?固定剂:蛋白质交联成凝胶,使核酸、糖类、脂类变为不溶性?缓冲剂:维持恒定PH值?附加剂:维持适当渗透压,避免肿胀、皱缩,避免析出、沉淀Р常用戊二醛、锇酸双固定法。Р2.固定:用化学固定剂迅速杀死细胞的过程。Р目的:保持生前结构及空间定位。Р【2】常用固定剂的特点Р(1)戊二醛(Glutraldehyde)? 1)2.5%戊二醛固定液的配制(见书)? 2)固定原理及优缺点?a、戊二醛对于蛋白质、多糖、核酸以及细胞内微管、滑面内质网、纺缍丝、胞饮小泡和细胞基质固定良好。?b、穿透力强,可达4mm/h,常用作前固定。?c、固定后可在4℃冰箱长时间保存(数周~数月)。?d、对酶的活性保存较好,适用于电镜细胞化学研究。?e、对脂肪不起固定作用。?f、无“电子染色”作用。?g、不稳定、易氧化。Р(2)锇酸(又称四氧化锇。OSO4, )Р1) 1%锇酸固定液的配制:(见书)?2)固定原理及优缺点?a、经典的固定剂。对蛋白质和脂质亲和力强。?b、有强烈的电子染色作用。?c、渗透较慢,0.25~0.5mm/h左右。常用作后固定。?d、对糖类和核酸保存很差,不保存酶活性。?e、固定时间不宜超过2小时。?f、提前配置,应低温、密封、避光保存。? 配置时应彻底清洗器皿,并要避免接触金属物品。?g、剧毒、易挥发。?h、比较昂贵。Р多聚甲醛(Paraformaldehyde):对细胞精细结构的保存不如戊二醛,但在酶活性的保存上却优于戊二醛,一般多用于组织化学或快速固定。Р高锰酸钾:对脂蛋白膜有良好的固定作用。Р(3)其它固定液:
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