2n? n 循环次数?实际拷贝数=(1+x)n? X 平均效率,约为0.85)Р缓冲液(10mM Tris.HCl/pH8.3-9.0),Mg2+)?模板DNA(单/双链)?引物(18~30bp)?4种脱氧三磷酸核苷(dNTP,2.5mM)?DNA聚合酶РPCR引物的设计一般原则?1.长度一般为18~30bp?2.两条引物间的Tm值越接近越好(2~5℃)?3.G/C和A/T碱基均匀分布,G+C含量在40~60%之间?4. 3’末端最好为G/C,但避免较密的C+C或G+CР引物? 一般溶成10 M的贮存液,使用浓度为0.1-0.5 M。?浓度过低则产量低,过高则易导致错配,PCR特异性下降。Р5.避免引物内部形成发夹结构或两个引物间形成二聚体?PCR引物的设计方法?遵循引物设计原则,使用引物设计软件进行;?F引物:从模板正义链上直接抄写18-30bp?R引物:将模板正义链反向互补,再抄写18-30bpРPCR仪РPCR注意的事项Р1.防止污染?试剂小量分装?吸头及EP管一次性使用?器皿及工作区域要分开,无菌操作?2.设立对照:?阳性对照: 阳性模板?阴性对照: 阴性模板、无模板?试剂对照: 除模板外的所有组分Р第二节 PCR产物的克隆Р一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点?在PCR引物的5’加上根据需要而设计的酶切位点,PCR产物内部没有该切点。?在酶切位点的5’加3个左右的保护碱基,其数目多少取决限制性内切酶的性质。?PCR物产物经电泳后回收后,直接用限制酶进行切割,纯化后与目标载体连接重组。Р二、TA克隆?Taq酶PCR产物的特点:该酶具有末端转移酶活性,通常在其产物DNA分子每条链的3’末端加上一个突出的A。?T载体:多克隆位点中间已开环的质粒载体,其每条链的3’末端具有一个突出的T,如promega公司的pGEM T-easy,Takara公司的pMD18-T。
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