699-1663РSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳Р电泳注意:? (1)所有蛋白样品定量一致,体积以一致,不够的用裂解液补满,样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样,Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积,这样可以避免最边上的孔道电泳时出现扩散,使最边上的孔道电泳出现误差。Р (2)Western Blot一般上样30-100微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。Р (3)浓缩胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水平线上进入分离胶,如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而在分离是理论上小电压长时间分离的效果会更好,浓缩胶80v,分离胶100v就能跑得很好,同时制胶前一定要使胶混匀,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶,使胶不均匀。Р辉骏生物:/ 免费服务热线:400-699-1663Р转膜РPVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理:? 一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差,背景相对叫弱。? 尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合(注:常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜),同时也有疏水作用,但相对较弱,PVDF膜和蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好,但背景相对叫强。Р分类:? 半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统,将膜,胶,滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的,叫湿法;用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。BIO-RAD的半干转运系统的弱点就是无法控温,当电流过高,而系统的散热又比较差,滤纸的吸水性比较差的情况下,就很容易烧胶。Р辉骏生物:/ 免费服务热线:400-699-1663
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