箱5天内完成测试,如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存,融解时应上下颠倒充分混匀,同时避免气泡。Р(三)具体程序? 1.包被抗原:用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.3 μg/ml,每孔加0.1 ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。? 洗涤缓冲液配方为:Tris 2.42克,1mol/L HCI 13mL,吐温-20(0.05%)0.5mL, 加蒸馏水至1000mL。? 2.待检血清反应:加1:8稀释(稀释液为生理盐水)的待检样品0.1 ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育60分钟,洗涤3次,每次3分钟。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)Р3.酶标抗体反应:于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)或SPA 0.1 ml,37℃孵育60分钟,洗涤3次,每次3分钟。? 4.显色反应:于各反应孔中加入等体积混合的显色底物A、 B溶液0.1 ml,37℃ 20分钟。? 底物A液(磷酸盐枸橼酸缓冲液,pH5.0)配方为:0.2mol/L Na2HPO4(28.4g/L) 25.7mL, 0.1mol/L枸橼酸(19.2g/L)24.3mL, H2O2 0.1% , 蒸馏水50mL。? 底物B液[TMB(四甲基联苯胺)使用液]配方为:TMB 3.90g, 枸橼酸10.52g, EDTA 1.86g, 甘油2000mL,DMSO300mL,加热溶解后加蒸馏水至10000mL。Р5.终止显色:于各反应孔中加入显色终止液(0.5 mol/L H2SO4)0.1mL 终止反应。? 6.结果判定:实验结果用酶标仪判读,被检孔OD值达阴性血清对照孔OD值的2.1倍时,始可判为阳性。?四、实验项目? (一)标本采集? (二)细菌培养? (三)涂片、G染色、荚膜染色、芽孢染色、光镜检查? (四)噬菌体裂解和青霉素敏感性试验? (五)PCR基因检测? (六)菌种保存
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