中,每个孔加入0.5ml细胞悬浮液,每空再加无抗生素培养基3ml,于37℃, 5%CO2培养。隔日确定生长良好后,即可接种测试样品。Р(3)供试品处理:Р细胞培养物将供试品经无抗生素培养液至少传一代,然后取细胞已长满的且3天未换液的细胞培养上清液待检。Р毒种悬液如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时,应用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。Р 其他供试品检查时所选用的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细胞。Р(4)DNA染色Р于制备好的指示细胞培养板中加入供试品(细胞培养上清液)2ml(毒种或其他供试品至少1ml),置5%二氧化碳孵箱36℃±1℃培养3~5天。指示细胞培养物至少传代1次,末代传代培养用含盖玻片的6孔培养板培养3~5天。Р①吸除培养液,于每个孔中加入5ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液,静置10 min后,吸除固定液。重复上述之步骤,风干10分钟。②于每个孔中,加入5ml Hoechst 33258 working solution,,加盖,室温下静置30min。③吸掉Hoechst 33258染液后,以5ml无菌水洗涤3次,吸出水后,盖玻片于空气中干燥,取洁净载玻片加封片液1滴,分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。④荧光显微镜观察。观察细胞核外是否有蓝色荧光小点或是丝状点之荧光物产生。Р用无抗生素培养基2ml替代供试品,同法操作,作为阴性对照。Р用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品,同法操作,作为阳性对照。Р(5)结果判定Р阴性对照—无生长(荧光显微镜下,只观察到Vero细胞的细胞核,测试样品没有支原体的污染。)Р阳性对照—生长( 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色荧光小点或是丝状点。其形状一致,与细胞残片染成之不规则点状物不同。)Р供试品—阴性—合格Р 供试品—阳性—重试—阳性—不合格
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