7.1 mL醋酸,充分混匀。最后以去离子水定容至1 000 mL即为50×TAE缓冲液,使用时稀释50倍即可。B.B.附录 B(规范性附录)菌落PCR测定B.1 制备DNA模板用无菌牙签挑取单个菌落到0.2 mLPCR管中,加入10 μL无菌1×TE(见附录A.1)缓冲液弹击混匀,标记,盖紧,100 ℃煮沸5 min,-20 ℃冷冻5 min(循环2次),5 000 r/min离心1 min,取上清液检测DNA模板浓度,用于后续PCR扩增。当样本量少时也可采用合适的试剂盒制备DNA模板。B.2 PCR扩增采用50 μLPCR反应体系:DNA模板浓度范围为0.2 ng/μL~2 ng/μL,(用核酸测定仪测定DNA模板浓度,根据浓度值计算模板添加体积),10×PCRBuffer(含Mg2+1.5 mM)5 μL,dNTP(10 mM)1 μL,上游引物(27F):5′TGGCTCAG3′,下游引物(1492R):5′TTGTTACGACTT3′(25 μM)各2 μL,Taq酶(2 U/μL)1 μL~2 μL,去离子水补至50 μL,混匀,稍离心。反应管置于PCR仪中,首先95 ℃预变性5 min;主循环30次:94 ℃30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃30 s(时间可根据片段长度调整);终延伸72 ℃10 min,4 ℃保存。注:不同细菌PCR程序可不同。B.3 电泳检测设置阳性样品对照(如大肠杆菌DNA)、阴性样品(如鱼的基因组DNA或细菌质粒DNA)对照、空白对照(无DNA)。1×TAE(见附录A.2)缓冲液配置含核酸染料的2 %琼脂糖凝胶,PCR扩增产物与6×上样缓冲液混合,同时以DL2000或同等大小的DNAMarker标准样品为对照。10 V/cm电泳30 min,凝胶成像系统拍摄电泳结果。_________________________________
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