法:Figure7.Workflowforpreparationofmulti-targetCRISPR/Cas9constructs(1)菌种活化和质粒提取制备:将pYLCRISPR/Cas9菌种(TOP10F’)和CRISPR/sgRNAvectors菌种(DH10B)分别在含有卡那霉素(25μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)平板培养基划线培养过夜,挑取单菌落培养1ml种子液,再扩大培养用于提取质粒。用2-3UBsaI试切~150ng质粒(10μl反应),dB条带(未切的80ng质粒为对照)。注:不要将保存的菌种直接接种!关键点:pYLCRISPR/Cas9载体较大(约15~16.5kb),拷贝数较低(pBR322复制子),用质粒小型柱提取纯化的回收率较低,因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒(如TIANGEN公司EndoFreeMaxiPlasmidKit)提取纯化(由于溶出的质粒DNA可能含有残留的洗液成分即乙醇,且体积大浓度低,最好再做一次标准的乙醇沉淀操作以去除残留乙醇和减少DNA溶液体积),或用普通碱裂解法提取(用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀)。溶解在TE(约0.5mg/l)保存。取部分质粒稀释成约100ng/l冷冻保存,作为步骤(10)使用。关键点:由于接下来要用到的BsaI是很容易失活的酶,有时新买的BsaI也是失活的!在进行以下步骤之前,先检测BsaI活性:配制10μlBsaI反应液,含有5UBsaI,~100ngpYLgRNA-U#(或其它有AmpR基因的质粒)。37℃反应15min后电泳检查,以未切的相同质粒为对照。pYLgRNA-U#的BsaI图谱见Figure3。为了尽可能保持酶活性,最好把BsaI分装成几管冷冻保存。NEB公司的BsaI-HF经过修饰以降低星活性,推荐使用NEBBsaI-HF和配套的CutSmartBuffer。
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