多靶点pCRISPR载体

/Cas9-MT(II)空载体为对照,确认空载体不能扩出相同长度产物);并用AscI切出串联的U6-gRNA表达盒片段(pYLCRISPR/Cas9-MT(II)空载体为对照)(1个表达盒约420bp )。一般不需要测序检测。如果要测序,用第9页的扩增引物从阳性克隆扩出表达盒片段(1个靶点),用U6上游引物测序。当2个靶点或以上,就只能将扩增产物克隆,再用靶点接头反向引物和相应的U6上游引物进行PCR,选出相应靶点的克隆进行测序。Р在农杆菌的稳定性检测:获得的克隆转化农杆菌,从农杆菌提取质粒,取约5ng质粒为模板再用所有靶点接头反向引物和U3/U6上游引物配对进行PCR确认。Р打靶效果检测:打靶成功往往在靶点缺失若干碱基。以靶点切点为中心,在两侧各离开约20-30 bp处合成引物(PCR产物约80-100 bp),扩增T0转化体gDNA(和野生型对照),PAGE电泳。如果转化体产生一些小条带(对照没有这些小条带),表明打靶可能成功了。可将小条带回收,再扩增和克隆到T-载体测序。如果靶点切点处有酶切位点,可酶切gDNA消除野生型背景后再扩增。为了减少测序费用,可在其中一条引物的5’端加入HindIII位点,将PCR产物HindIII切后,就可以反向双体形式连接到T-Р载体。这样测序1个克隆可以获得2个片段序列。Р附加序列信息:РpAtU6-gRNA:РBackground of the CRISPR system:Р1. The original funtion of CRISPR: Р名词解释:РcrRNA: CRISPR RNA;tracrRNA: trans-activating CRISPR RNA;PAM : protospacer adjacent motif;Р2. Cas9 can be guided by single chimeric RNA(gRNA):